L'ADN recombinant són molècules formades mitjançant tècniques de recombinació genètica de laboratori per combinar material genètic de múltiples fonts. És possible perquè les molècules d'ADN de tots els organismes tenen la mateixa estructura química i només difereixen en la seqüència de nucleòtids que hi ha al seu interior.
Creació
La clonació molecular és un procés de laboratori utilitzat per crear ADN recombinant. És un dels dos mètodes més utilitzats, juntament amb la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Us permet controlar la replicació de qualsevol seqüència d'ADN concreta escollida per l'experimentador.
Hi ha dues diferències fonamentals entre els mètodes d'ADN recombinant. Una és que la clonació molecular implica la replicació en una cèl·lula viva, mentre que la PCR implica in vitro. Una altra diferència és que el primer mètode permet tallar i enganxar seqüències d'ADN, mentre que el segon es millora copiant l'ordre existent.
ADN vectorial
Obtenir ADN recombinant requereix un vector de clonació. Es deriva de plasmidis o virus i és un segment relativament petit. L'elecció del vector per a la clonació molecular depèn de l'elecció de l'organisme hoste, la mida de l'ADN a clonar i si s'han d'expressar molècules estranyes. Els segments es poden combinar mitjançant diversos mètodes, com ara la clonació d'enzims de restricció/ligasa o l'assemblatge de Gibson.
Clonació
En els protocols estàndard, la clonació implica set passos.
- Seleccioneu l'organisme hoste i el vector de clonació.
- Obtenció d'un vector d'ADN.
- Formació d'ADN clonat.
- Creació d'ADN recombinant.
- Introduint-lo a l'organisme hoste.
- Selecció d'organismes que la contenen.
- Selecció de clons amb insercions d'ADN i propietats biològiques desitjades.
Després del trasplantament a l'organisme hoste, les molècules estranyes contingudes en la construcció recombinant poden o no expressar-se. L'expressió requereix la reestructuració del gen per incloure seqüències necessàries per a la producció d'ADN. L'està utilitzant la màquina de traducció de l'amfitrió.
Com funciona
L'ADN recombinant funciona quan la cèl·lula hoste expressa una proteïna a partir de gens recombinants. L'expressió depèn d'envoltar el gen d'un conjunt de senyals que proporcionen instruccions per a la seva transcripció. Inclou el promotor, la unió de ribosoma i el terminador.
Sorgeixen problemes si el genconté introns o senyals que actuen com a terminadors de l'hoste bacterià. Això condueix a la terminació prematura. La proteïna recombinant pot ser processada, plegada o degradada de manera inadequada. La seva producció en sistemes eucariotes sol produir-se en llevats i fongs filamentosos. L'ús de gàbies d'animals és difícil a causa de la necessitat d'una superfície de suport sòlida per a molts.
Propietats dels organismes
Els organismes que contenen molècules d'ADN recombinant tenen fenotips aparentment normals. El seu aspecte, comportament i metabolisme no solen canviar. L'única manera de demostrar la presència de seqüències recombinants és examinar el propi DNA mitjançant la prova de reacció en cadena de la polimerasa.
En alguns casos, l'ADN recombinant pot tenir efectes nocius. Això pot passar quan el seu fragment que conté un promotor actiu es troba al costat d'un gen de cèl·lula hoste que abans era silenciós.
Utilitzar
La tecnologia d'ADN recombinant s'utilitza àmpliament en biotecnologia, medicina i investigació. Les seves proteïnes i altres productes es poden trobar a gairebé totes les farmàcies occidentals, clíniques veterinàries, consultoris mèdics, laboratoris mèdics o biològics.
L'aplicació més habitual és en la investigació bàsica, on la tecnologia és essencial per a bona part del treball actual en ciències biològiques i biomèdiques. L'ADN recombinant s'utilitza per identificar, mapejar i seqüenciar gens, i per determinar-losfuncions. Les sondes d'ADNr s'utilitzen per analitzar l'expressió gènica en cèl·lules individuals i en teixits d'organismes sencers. Les proteïnes recombinants s'utilitzen com a reactius en experiments de laboratori. A continuació es donen alguns exemples específics.
Quimosina recombinant
Es troba a l'abomasum, la quimosina és un enzim necessari per fer formatge. Va ser el primer additiu alimentari modificat genèticament utilitzat a la indústria. Un enzim recombinant produït microbiològicament, estructuralment idèntic a un enzim derivat del vedell, és més barat i es produeix en quantitats més grans.
Insulina humana recombinant
Pràcticament substitueix la insulina derivada de fonts animals (p. ex. porcs i bestiar) per al tractament de la diabetis insulinodependent. La insulina recombinant es sintetitza introduint el gen de la insulina humana en bacteris del gènere Eterichia o llevats.
Hormona del creixement
Receptat per a pacients la glàndula pituïtària dels quals no produeix prou hormona de creixement per donar suport al desenvolupament normal. Abans que l'hormona del creixement recombinant estigués disponible, es va obtenir de la glàndula pituïtària dels cadàvers. Aquesta pràctica insegura ha fet que alguns pacients desenvolupin la mal altia de Creutzfeldt-Jakob.
Factor de coagulació recombinant
Aquesta és una proteïna que coagula la sang que s'administra a pacients amb formes d'hemofília amb trastorns hemorràgics. Són incapaços de produirfactor VIII en quantitats suficients. Abans del desenvolupament del factor VIII recombinant, la proteïna es va fer processant grans quantitats de sang humana de múltiples donants. Això comportava un risc molt alt de transmetre mal alties infeccioses.
Diagnòstic de la infecció pel VIH
Cada un dels tres mètodes àmpliament utilitzats per diagnosticar la infecció pel VIH es va desenvolupar mitjançant ADN recombinant. Una prova d'anticossos utilitza la seva proteïna. Detecta la presència de material genètic del VIH mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa. El desenvolupament de la prova va ser possible gràcies a la clonació molecular i la seqüenciació dels genomes del VIH.
