PCR, o reacció en cadena de la polimerasa, és una tècnica de laboratori sofisticada que s'utilitza àmpliament en medicina i altres camps científics. El diagnòstic de PCR en un moment es va convertir en un autèntic avenç en la ciència.
Descripció
La PCR quantitativa és un tipus de PCR en temps real.
S'entén com una variant de la PCR, en la qual es registra constantment la cinètica de la reacció, que permet avaluar qualitativament el contingut de seqüències específiques de nucleòtids d'ADN en una barreja molecular complexa.
El mètode de PCR quantitatiu es comentarà amb més detall a continuació.
L'essència de l'anàlisi
Els mètodes culturals i serològics s'utilitzen especialment per diagnosticar infeccions. Sota el primer, es determinen anticossos contra un patogen infecciós en el sèrum sanguini. En el segon, el material biològic extret d'una persona mal alta s'utilitza per sembrar un medi específic favorable per al creixement de colònies patògens. Diagnòstic en tots dosEl cas pot durar dies o setmanes.
L'examen PCR es pot fer amb diferents materials biològics que s'obtenen d'una persona mal alta. La sang i altres medis i fluids patològics, fisiològics i biològics actuen com a mostres. Podeu fer PCR femtes o orina.
Les infeccions atípiques i víriques es diagnostiquen més sovint per PCR quantitativa, ja que pot ser que no siguin fàcils de diagnosticar per la naturalesa específica del procés patològic que provoquen. Per determinar aquestes infeccions, cal un temps, durant el qual comencen a produir anticossos al cos, determinats per mètodes serològics. Però això és inacceptable en alguns casos.
Mètode de realització
Mètode PCR: detecció de laboratori d'infecció en mostres aïllades del pacient (in vitro).
Per dur a terme una reacció en cadena de la polimerasa, cal un conjunt de reactius especials.
El material de prova s'introdueix en tubs d'assaig amb reactius. Els tubs d'assaig es col·loquen en un aparell especial: un amplificador de PCR, que està dissenyat per amplificar (augmentar el nombre) dels fragments d'ARN o ADN desitjats, l'amplificador de PCR funciona en un mode cíclic. En qualsevol cicle, si les mostres contenen la seqüència d'ARN o ADN del patogen, cada cop s'acumulen més còpies de les partícules d'aquests àcids nucleics a la solució. Podeu determinar la presència del patogen i la seva quantitat a les mostres.
Tipus de PCR
L'anàlisi qualitativa per PCR us permet obtenir el resultat següent:
- negatiu quan el patogen d'interès no es troba a les mostres;
- positiu si es troben seqüències a les mostres que són característiques d'un determinat patogen.
Amb un resultat de PCR positiu, podem parlar amb un 95% de precisió sobre la presència d'una infecció diagnosticada. Al mateix temps, la precisió dels conjunts de PCR utilitzats amb finalitats de diagnòstic arriba al 100%.
En general, el 5% dels resultats incorrectes estan determinats pel factor humà. Per exemple, les infraccions de la tècnica d'anàlisi i emmagatzematge de reactius poden reduir significativament la precisió de l'estudi.
La PCR quantitativa defineix el concepte de càrrega viral. És possible determinar quants conjunts d'ADN patògen hi havia a les mostres preses del pacient.
La gravetat de la infecció és directament proporcional a l'augment del seu nombre. També podeu determinar l'èxit de la teràpia per reduir la càrrega viral.
Enviament per a biomaterial PCR
La PCR quantitativa es realitza a la clínica, principalment al matí. Durant la visita al metge s'indicarà al pacient què cal prendre: raspat, frotis, orina o sang. La PCR pot detectar patògens independentment del nivell de contaminació del material.
Per a una anàlisi positiva, en teoria, només es requereix la presència d'un patogen a les mostres. A la pràctica, intenten crear condicions encara més favorables. Hi ha algunes recomanacions per a això:
- si prenen un raspat o un hisop dels genitalsòrgans, cal que no tingueu relacions íntimes tres dies abans de l'estudi;
- no pots fer dutxa amb fàrmacs antibacterians ni rentar-te abans de l'anàlisi;
- tres hores abans de fer un frotis de la uretra, cal tenir paciència i no buidar els intestins.
No seguiu aquestes regles quan doneu sang.
Com s'interpreten els resultats de l'anàlisi quantitativa de PCR?
Avaluació quantitativa dels resultats obtinguts
En una sèrie de situacions clíniques, apareix el problema de l'eficàcia del tractament i/o la dinàmica del procés patològic. Aquestes preguntes són especialment rellevants quan s'examinen persones amb infeccions cròniques (virus de la immunodeficiència humana, hepatitis B i C). A l'hora de diagnosticar, es basen en el fet que l'acumulació d'amplicons (productes de PCR) és proporcional a la presència de còpies del gen desitjat a la mostra analitzada.
Per descomptat, tenint en compte els resultats de la PCR quantitativa es fa per electroforesi en gel amb l'estudi de la intensitat de senyals especials de PCR. A més, un requisit previ per a una correcta avaluació quantitativa dels resultats obtinguts són mostres de control fiables positives que continguin un nombre conegut de còpies del gen desitjat (per exemple, mil còpies del gen de l'hepatitis C per a una reacció de PCR). Diverses dilucions en sèrie del control quantitatiu permeten generar corbes de calibratge i s'utilitzen per avaluar el contingut de genocòpies clíniques en mostres clíniques.
En la definició de PCR quantitativa, un èxit clau ha estat la creaciósondes d'ADN fluorescents que s'afegeixen a la barreja de reacció simultàniament amb cebadors senzills i us permeten fer un seguiment del procés de PCR a temps, és a dir, PCR en temps real.
La metodologia TaqMan fa referència a la síntesi de sondes d'ADN fluorescents específiques de la part mitjana de l'amplicó i que tenen dues etiquetes als extrems. Un d'ells és una etiqueta fluorescent, el segon és una molècula extintiva per a aquesta fluorescència.
Un dispositiu especial, que és un híbrid d'un fluorímetre i un termobloc-amplificador, fa mesures constants de fluorescència a cada tub d'assaig (principi de PCR en temps real). Després de 20-40 cicles de PCR, s'obtindran corbes individuals per a cada mostra. El nombre de còpies del gen desitjat que conté la mostra de prova es pot calcular a partir de corbes de calibratge amb mostres de control.
A més, una característica important de la implementació de la PCR pel mètode fluorescent és que no cal obrir tubs amb una barreja de PCR quan es tenen en compte els resultats. Això redueix la possibilitat de contaminació de l'habitació amb productes d'amplificació i no cal assignar àrees de treball especials per a l'electroforesi.
Què mostra una transcripció quantitativa de PCR?
Què s'està descobrint?
A través d'un mètode com la PCR quantitativa, es troben canvis qualitatius en els gens: insercions, delecions i mutacions puntuals. Però amb alguns trastorns hereditaris, els símptomes corresponents apareixen com a resposta a un canvi en el contingut de determinats gens.
GràciesL'anàlisi quantitativa dóna un resultat numèric, sovint en UI/ml. Això vol dir que en un mil·lilitre de la mostra de prova es va trobar un nombre determinat de còpies de l'ARN o l'ADN del patogen, mesurades en unitats internacionals..
Depenent de la magnitud, es diagnostica la gravetat de la infecció. La sang es fa habitualment per determinar la càrrega viral, ja que els virus es mouen lliurement a la sang durant la mal altia.
Característiques
La PCR quantitativa en una anàlisi de sang té dues característiques.
- L'anàlisi es realitza en presència d'encebadors o trifosfats desoxiribonucleòsids, que estan marcats amb un marcador fluorescent o radioactiu per determinar amb precisió el contingut del producte de PCR format.
- En el procés de PCR, acabeu la reacció abans que apareguin massa productes de PCR. Això es deu al fet que en l'etapa final de saturació, quan hi ha molts productes de PCR, tant el propi enzim com els substrats actuen com a enllaços limitants d'aquesta reacció. El final del següent cicle de PCR en aquestes condicions ja no es caracteritza per una duplicació del nombre de productes de PCR, s'anivellen diferències quantitatives insignificants entre diferents mostres, que es defineixen força clarament en les primeres etapes després de passar per una sèrie de cicles de reacció..
Cost dels diagnòstics de PCR
La investigació PCR té un cost, que depèn del tipus d'infecció que es provarà, de la metodologia d'anàlisi i del material de prova. Per determinar una infecció, haureu de cedir dins200-800 rubles. També s'afegeix una tarifa per prendre biomaterial: uns 400 rubles.
