La cromatografia és un dels mètodes per separar substàncies. S'utilitza per a l'anàlisi qualitativa i quantitativa posterior de les propietats físiques i químiques de les micropartícules. Una variació d'aquesta tecnologia és la cromatografia d'afinitat. La idea de diferenciar compostos proteics mitjançant la propietat de l'afinitat molecular és coneguda a la ciència des de fa diverses dècades. No obstant això, només ha rebut el seu desenvolupament en els últims anys, després de la introducció de materials hidròfils altament porosos utilitzats com a matriu. Aquest mètode permet resoldre tant problemes analítics (separació de substàncies i la seva identificació) com problemes preparatius (purificació, concentració).
Essència
La cromatografia d'afinitat (de la paraula llatina affinis - "adjacent", "relacionat") es basa en interaccions d'afinitat, que són la formació d'enllaços molt específics entre una molècula espaciadora (lligant o afinant) i una molècula diana. Aquests mecanismes estan molt estesos en la naturalesa (connexió de mediadors o hormones i receptors, anticossos iantígens, hibridació de polinucleòtids i altres tipus de processos). En medicina, la cromatografia d'afinitat s'utilitza amb finalitats pràctiques des de 1951
Els components es separen de la següent manera:
- La solució de treballque conté la substància a aïllar es fa passar pel sorbent;
- lligand dipositat a la matriu sorbent reté aquesta substància;
- es concentra (acumulació);
- extracció de la substància aïllada del sorbent mitjançant rentat amb un dissolvent.
Aquest mètode us permet aïllar cèl·lules senceres. La diferència amb la cromatografia d'absorció tradicional és que hi ha una forta unió bioespecífica del component aïllat al sorbent, que es caracteritza per una alta selectivitat.
Adsorbents
Les substàncies següents s'utilitzen com a adsorbents:
- Compostos de gel a base d'agarosa, un polisacàrid obtingut a partir d'agar. Les més utilitzades són 3 varietats: sepharose 4B, CL (agarosa reticulada) i affi-gel. Aquesta darrera composició és un gel modificat d'agarosa i poliacrilamida. Té una major inercia biològica, una alta resistència química i tèrmica.
- Sílice (gel de sílice).
- Vidre.
- Polímers orgànics.
Per eliminar els obstacles mecànics durant el contacte del lligand, s'utilitzen substàncies addicionals per separar-lo del transportador (pèptids, diamines, poliamines, oligosacàrids).
Equip
L'equip de cromatografia d'afinitat inclou les unitats principals següents:
- tancs d'emmagatzematge per a la fase mòbil (eluent);
- bombes d' alta pressió per a subministrament mitjà (la majoria de les vegades alternatives);
- filtre per netejar els eluents de la pols;
- dispositiu de dosificació;
- columna cromatogràfica per a la separació de mescles;
- detector per detectar components separats que surten de la columna;
- enregistradors de cromatograma i unitat de microprocessador (ordinador).
Per tal de reduir la quantitat d'aire dissolt, l'heli passa primer per la fase mòbil. Per canviar la concentració de l'eluent, s'instal·len diverses bombes controlades pel programador. Les columnes cromatogràfiques estan fetes d'acer inoxidable (per augmentar els requisits de resistència a la corrosió), vidre (opció universal) o acrílic. Amb finalitats preparatives, el seu diàmetre pot variar entre 2 i 70 cm. En cromatografia analítica s'utilitzen microcolumnes de Ø10-150 µm.
Per augmentar la sensibilitat dels detectors, s'introdueixen reactius a la mescla, que contribueixen a la formació de substàncies que absorbeixen més raigs a la regió ultraviolada o visible de l'espectre.
Metodologia
Hi ha dos tipus principals de cromatografia d'afinitat líquida:
- Columna, en la qual la columna s'omple amb una fase estacionària i s'hi passa una mescla amb un fluxeluent. La separació es pot produir sota pressió o per gravetat.
- Capa fina. L'eluent es mou al llarg de la capa adsorbent plana sota la influència de les forces capil·lars. L'adsorbent s'aplica a una placa de vidre, una vareta de ceràmica o de quars, una làmina metàl·lica.
Les etapes principals del treball inclouen:
- preparació de l'adsorbent, fixació del lligand al suport;
- alimentant la barreja de separació a la columna cromatogràfica;
- càrrega de fase mòbil, unió de components per lligand;
- substitució de fase per aïllar la substància lligada.
Destinació
La cromatografia d'afinitat s'utilitza per aïllar els següents tipus de substàncies (el tipus de lligand utilitzat s'indica entre parèntesis):
- anàlegs d'inhibidors enzimàtics, substrats i cofactors (enzims);
- substàncies bioorgàniques amb signes d'alienitat genètica, virus i cèl·lules (anticossos);
- hidrats de carboni d' alt pes molecular, polímers de monosacàrids, glicoproteïnes (lectines);
- proteïnes nuclears, nucleotidiltransferases (àcids nucleics);
- receptors, transport de proteïnes (vitaminas, hormones);
- proteïnes que interaccionen amb les membranes cel·lulars (cèl·lules).
Aquesta tecnologia també s'utilitza per obtenir enzims immobilitzats, i unir-los a la cel·lulosa permet la producció d'immunosorbents.
Cromatografia de proteïnes d'unió a l'ADN
L'aïllament de les proteïnes d'unió a l'ADN es realitza utilitzantheparina. Aquest glicosaminoglicà és capaç d'unir una àmplia gamma de molècules. La cromatografia d'afinitat de proteïnes d'aquest grup s'utilitza per aïllar substàncies com ara:
- factors d'inici i allargament de la traducció (síntesi de molècules d'àcid nucleic i proteïnes);
- retrictases (enzims que reconeixen determinades seqüències de l'ADN de doble cadena);
- ADN lligases i polimerases (enzims que catalitzen la unió de dues molècules per formar un nou enllaç químic i participen en la replicació de l'ADN);
- inhibidors de la serina proteasa que tenen un paper important en els processos immunològics i inflamatoris;
- factors de creixement: fibroblast, Schwann, endotelial;
- proteïnes de la matriu extracel·lular;
- receptors hormonals;
- lipoproteïnes.
Dignitat
Aquest mètode és un dels més específics per a l'aïllament de compostos reactius (enzims i agregats més grans - virus). Tanmateix, s'utilitza no només per aïllar substàncies biològicament actives.
Detecció d'anticossos en petites quantitats, avaluació quantitativa de l'àcid poliadenílic, determinació ràpida de les masses moleculars de les deshidrogenases, eliminació de certs contaminants, estudi de la cinètica d'activació de la forma inactiva de la tripsina, l'estructura molecular de l'ésser humà interferons: aquesta no és tota la llista d'estudis en què s'utilitza l'afinitat.cromatografia. L'ús a la clínica es deu als seus avantatges com ara:
- Capacitat de neteja efectivaproteïnes, polisacàrids, àcids nucleics. Difereixen lleugerament en les seves propietats físiques i químiques i perden activitat durant la hidròlisi, la desnaturalització i altres tipus de tractament utilitzats en altres mètodes.
- La velocitat de separació de les substàncies, la naturalesa dinàmica del procés.
- No cal una purificació especial d'enzims i una homogeneïtzació d'isoenzims per determinar les constants de dissociació.
- Capaç de separar una àmplia gamma de substàncies.
- Baix consum de lligands.
- Possibilitat de separació de substàncies en grans volums.
- Procés reversible d'unió de macromolècules biològiques.
Aquesta tècnica es pot combinar amb altres, per imposar un camp addicional (gravitatori, electromagnètic). Això us permet ampliar les capacitats tècniques de la cromatografia.
Enginyeria enzimàtica
Gràcies a aquest mètode, va començar el desenvolupament actiu d'una nova branca de la biotecnologia: l'enginyeria enzimàtica.
La cromatografia d'afinitat per a l'aïllament d'enzims té els avantatges següents:
- obtenció d'enzims en grans quantitats com a resultat de menys temps, com a resultat - la seva reducció de preu;
- la immobilització d'enzims pot ampliar significativament l'abast de la seva aplicació en medicina i indústria;
- L'associació d'enzims amb un suport sòlid insoluble permet estudiar la influència del microambient i la direcció de les reaccions, que tenen un paper important en els processos naturals i fisiològics.
