La citometria de flux és un mètode d'investigació citològica utilitzat per a l'anàlisi en profunditat de les cèl·lules. El seu avantatge és que permet estudiar cada cèl·lula individualment. Aquest tipus d'anàlisi ajuda a avaluar diversos paràmetres en centenars de cel·les en qüestió de segons. Com a resultat, la citofluorimetria es considera un dels mètodes d'anàlisi més ràpids i precisos actualment disponibles per als científics i els metges.
Principi
El principi de la citometria de flux es basa en la mesura de la dispersió de la llum i la luminescència (fluorescència) de les cèl·lules. La suspensió cel·lular es fa passar com un corrent a gran velocitat a través de la cèl·lula del citòmetre, on s'irradia amb un làser. També s'hi realitza l'anomenat focus hidrodinàmic. El seu mecanisme és que el flux de la cèl·lula amb les partícules estudiades a la sortida flueix al raig extern, que té una velocitat més alta. Com a resultat, les partícules s'alineen en una cadena ordenada.
Les precèl·lules estan etiquetades amb colorants fluorescents especials (fluorocroms). Gràcies a ells, el raig làserexcita un resplendor secundari. Els senyals lluminosos rebuts són registrats per detectors. Posteriorment, la informació es processa mitjançant algorismes de programari que us permeten comptar poblacions cel·lulars individuals que difereixen en alguns criteris.
La investigació amb microscòpia convencional sovint no aconsegueix distingir entre cèl·lules diferents perquè tenen el mateix aspecte. La citofluorimetria pot proporcionar altres dades (integritat de l'estructura de l'ADN), analitzar l'expressió de proteïnes i la supervivència cel·lular.
Com que l'excitació dels fluorocroms requereix feixos de llum amb diferents longituds d'ona, així com diferents tipus de detectors, les instal·lacions modernes estan equipades amb diversos canals de detecció (de 4 a 30). El nombre d'emissors làser pot ser d'1 a 7. Els dispositius més complexos permeten estudis multiparàmetres de diverses propietats de partícules alhora.
Avantatges i desavantatges
Els avantatges de la citometria de flux inclouen:
- alta velocitat de processament (registre de fins a 30 mil esdeveniments en 1 segon);
- possibilitat d'estudiar un gran nombre de cèl·lules (fins a 100 milions en una mostra);
- Quantificació de la intensitat de la llum fluorescent;
- anàlisi de cada cel·la;
- estudi simultani de processos heterogenis;
- separació automàtica de dades per poblacions cel·lulars;
- visualització de qualitat dels resultats.
Una altra característica d'aquesta tecnologia és aquestala partícula analitzada es pot tacar amb diverses solucions fluorescents. Gràcies a això, es produeix un estudi multiparàmetre.
Els desavantatges inclouen la complexitat de l'equip tècnic i la necessitat d'una preparació especial de la mostra.
Citòmetres
Els primers dispositius d'aquest tipus van aparèixer ja l'any 1968 a Alemanya, però es van generalitzar molt més tard. Actualment, tots els dispositius que funcionen pel mètode de citometria de flux es poden dividir en 2 tipus:
- dispositius que mesuren la radiació fluorescent (dues o més longituds d'ona), la dispersió de la llum de 10° i 90° (detector de dispersió lateral i d'angle baix);
- dispositius que, a més de mesurar diversos paràmetres mòbils, s'organitzen automàticament en grups segons aquests criteris.
El detector de dispersió cap endavant està dissenyat per determinar la mida de la cèl·lula, i el dispositiu de dispersió lateral us permet obtenir informació sobre la presència de grànuls intracel·lulars, la relació de volum del citoplasma i el nucli.
Els citòmetres clàssics, a diferència dels microscopis de llum, no permeten obtenir una imatge d'una cèl·lula. Tanmateix, en els darrers anys s'han desenvolupat dispositius combinats que són capaços de combinar les capacitats d'un microscopi i un citofluorímetre. Es parlaran a continuació.
Citòmetres d'imatge
Per als instruments utilitzats en citometria de flux clàssica,una característica és característica: si es registren esdeveniments rars a la població de cèl·lules analitzades, no hi ha manera d'avaluar quina és la seva essència. Aquestes partícules poden ser les restes de cèl·lules mortes o un grup rar d'elles. En els dispositius convencionals, aquestes dades s'exclouen del flux general d'esdeveniments, però són aquestes les que poden ser d'especial valor per a l'anàlisi científica i clínica.
La nova generació de citòmetres de flux d'imatge us permet capturar una imatge de cada cèl·lula que passa al flux per la zona del detector. És fàcil de veure-ho fent clic a l'àrea corresponent del diagrama, que es mostra al monitor de l'ordinador.
Àrees d'aplicació
La citometria de flux és un mètode universal que s'utilitza en molts camps de la medicina i la ciència:
- immunologia;
- oncologia;
- transplantologia (trasplantament de medul·la òssia vermella, cèl·lules mare);
- hematologia;
- toxicologia;
- bioquímica (mesura de l'acidesa dins de la cèl·lula, estudi d' altres paràmetres);
- farmacologia (creació de nous fàrmacs);
- microbiologia;
- parasitologia i virologia;
- oceanologia (estudi del fitoplàncton per avaluar l'estat de les masses d'aigua i altres tasques);
- nanotecnologia i anàlisi de micropartícules.
Immunologia
El sistema immunitari humà està format per una gran varietat de cèl·lules. La citometria de flux en immunologia permet avaluar-ne l'estructura i les funcions, és a dir, dur a terme actuacions morfofuncionals.anàlisi.
Aquestes investigacions ajuden a entendre la naturalesa complexa de la immunitat. Els fenotips cel·lulars canvien com a conseqüència de l'activació per antígens, el desenvolupament de patologies i altres factors. La citofluorometria pot separar subpoblacions de cèl·lules immunitàries en una barreja complexa i avaluar tots els seus canvis al llarg del temps.
Oncologia
Una de les tasques més importants en oncologia és la diferenciació de cèl·lules segons el seu tipus. El principi d'anàlisi per citometria de flux en oncohematologia es basa en el següent fenomen: quan una mostra es tracta amb un colorant fluorescent especial, s'uneix a proteïnes citoplasmàtiques. Després de la divisió en cèl·lules en proliferació activa, el seu contingut disminueix a la meitat. En conseqüència, la intensitat de la luminescència cel·lular es duplica.
Hi ha altres maneres de detectar cèl·lules en proliferació:
- ús de colorants que s'uneixen a l'ADN (iodur de propidi);
- ús d'uracil etiquetat;
- registre d'un nivell augmentat d'expressió de proteïnes ciclina, que estan implicades en la regulació del cicle cel·lular.
